檢測原理
試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被傳染性胸膜肺炎抗原的包被微孔中,依次加入標本、HRP標記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD 值),與CUT OFF值相比較,從而判定標本中傳染性胸膜肺炎(SIP)的存在與否。
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無 |
陰性對照 | 0.5mL | 0.5mL | 無 |
陽性對照 | 0.5mL | 0.5mL | 無 |
檢測抗原-HRP | 10mL | 5mL | 無 |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進行稀釋 |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無 |
底物A | 6mL | 3mL | 無 |
底物B | 6mL | 3mL | 無 |
終止液 | 6mL | 3mL | 無 |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無 |
說明書 | 1份 | 1份 | 無 |
自封袋 | 1個 | 1個 | 無 |
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設置陰、陽性對照孔和樣本孔,陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各50μL;
3. 待測樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;
4. 隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗原100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
1. 試驗有效性:陽性對照孔OD值平均值≥1.00;
陰性對照孔OD值平均值≤0.15。
2. 臨界值(Cut off)計算:臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
3. 陰性判斷:樣品OD值<臨界值(Cut off),樣品為陰性
4. 陽性判斷:樣品OD值>臨界值(Cut off),樣品為陽性
試劑盒性能
1. 準確性:陽性對照孔OD值平均值≥1.00;陰性對照孔OD值平均值≤0.15,說明試驗結(jié)果有效。
2. 特異性:不與其它可溶性結(jié)構類似物交叉反應。
3. 重復性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
4. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
5. 有效期:6個月
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